用于成骨的新型纳米振动生物反应器的设计 构建和表征

在再生医学中，科学家们的目标是显着推进可以控制干细胞谱系承诺的技术。例如，纳米尺度的间充质干细胞(MSC)的机械刺激可以激活机械转导途径以刺激2-D和3-D培养物中的骨生成(骨发育)。这种工作可以通过从自体或同种异体中产生移植材料来彻底改变骨移植手术MSCs的来源没有化学诱导这种现象。由于对临床使用的细胞的这种机械刺激的生物医学兴趣的增加，研究人员和临床医生都需要可扩展的生物反应器系统以提供始终可重复的结果。在现在发表在科学报告上的一项新研究中，Paul Campsie和生物医学工程，计算，物理和分子，细胞和系统生物学系的多学科研究人员团队设计了一种新的生物反应器系统，以满足现有的要求。

新仪器包含一个用于生物反应的振动板，校准和优化1 kHz的纳米振动，一个产生30 nm振幅的电源单元和用于细胞生长的定制六孔培养器皿。培养皿包含磁性插入物，用于连接生物反应器的磁振板。他们评估了成骨蛋白的表达，以确认在系统内的初始生物实验后MSC的分化。Campsie等人。进行3-D凝胶构造的原子力显微镜(AFM)以验证在振动刺激期间不发生凝胶的应变硬化。结果证实细胞分化是仅由生物反应器提供的纳米振动刺激的结果。

由于与骨质疏松症和骨关节炎等年龄相关的病症引起的骨骼损伤的发生率增加是人类生命消耗质量的衡量标准。增加骨密度或骨折愈合的治疗方法的发展是间充质干细胞(MSC)再生潜能的主要目标。研究人员已经证明了使用几种方法(包括被动和主动策略)通过机械刺激控制骨髓间充质干细胞的成骨(骨骼发育)。被动方法通常改变基底形貌以影响细胞粘附特征，而主动方法包括暴露于来自外部来源的各种力。

在ANSYS工作台17.1中进行有限元分析，以确定十三和十五压电阵列顶板布置上1kHz的谐波响应。(A)十三个压电阵列图。(B)十五个压电阵列图。(C)在1kHz下预测十三个压电阵列的纳米级位移。(D)在1kHz下预测十五个压电阵列的纳米级位移。图片来源：科学报告，doi：10.1038 / s41598-019-49422-4。

Campsie等人目前的工作。打算在MSC的受控骨生成的预先存在的设计上取得进展，以构建适用于小规模临床试验的良好生产规范(GMP)兼容系统。在建造时，该团队使用激光干涉仪精确测量生物反应器顶板和用于培养器皿的井内的振动位移，以验证他们基于有限元分析(FEA)模型开发的设备。该团队使用直接数字合成波形 (DDS)发生器和重建滤波器，用于去除DDS输出的高频分量，从而产生1 kHZ的纯正弦波输出，以实现精确的纳米振动。

研究小组通过进行生物实验来量化生物反应器系统的运行，以量化暴露于纳米振动刺激的MSC的成骨蛋白表达。他们对实验中使用的胶原凝胶进行了AFM测量，以确定从培养皿传递到凝胶中的振动。然后他们表明，凝胶的刚度对于发生的纳米振动没有显着增加。

不同剂量的等离子体处理后的PP培养器皿的水接触角测量和在PP和聚苯乙烯(PS)6孔板上的MG63细胞(成骨细胞)的显微镜图像。等离子体处理(A)后的WCA测量曲线显示，需要至少30秒才能将WCA显着改变至允许细胞粘附和增殖的水平。(B)血浆处理前PP63孔板上MG63细胞不粘附的图像，(C)血浆处理的PP6孔板上MG63细胞的粘附和增殖，和(D)标准培养的MG63细胞康宁PS 6孔板。图片来源：科学报告，doi：10.1038 / s41598-019-49422-4。

Campsie等人。构建了具有特定材料选择和培养器附件的生物反应器，以在1Hz和5kHz的频率之间提供最佳的纳米级振动。它们确保装置的共振频率远高于操作频率，以防止共振放大或阻尼。为了确定设备的适当尺寸，研究团队使用ANSYS Workbench软件执行了FEA 。科学家通过使用13到15个压电阵列以低成本创造了生物反应器为了它的建设。产品设计允许细胞的最小和最大位移的不同交替带，以在整个培养器皿中接收不一致的振动水平。该团队估计了压电致动器和其他设备组件的固有共振频率，以了解它们对实验装置的影响。

然后，研究小组使用等离子体表面活化来改变塑料培养器皿的表面化学，以帮助细胞粘附和增殖，从而增加聚合物的表面能。在空气等离子体处理五分钟后，他们培养人类成骨细胞样细胞以观察细胞与培养器皿的附着增加。他们测量了聚合物的水接触角，以确定改性的表面能和表面润湿性。科学家们展示了聚合物培养皿等离子体活化的原理验证及其对有利细胞附着的表面润湿性的影响。他们的目标是进一步开发培养皿表面，以确保其稳定性和保质期。

TOP：生物反应器振动板，注塑成型PP 6孔培养皿。(A)改进型生物反应器具有较轻的底座，提手和凹底板，以及设计用于输出1 kHz和30 nm位移幅度的正弦波的电源。(B)注射成型的PP培养器皿，在每个孔的底部装有halbach铁氧体环形磁铁。框架和孔壁的厚度为1.5毫米。BOTTOM：干涉仪测量设置和输出信号。(A)为了测量纳米级位移，干涉仪发射来自激光头的激光束，该激光束被反射回被测物体上的光电探测器(也在激光头内)。对产生的光学干涉图案的分析允许获得位移。(B)由干涉仪测量的时间序列数据的示例。(C)时间序列数据的FFT分析示例。可清楚地看到生物反应器的1kHz峰值，并且在750Hz处也存在大的峰值，然而，该信号由干涉仪的参考镜产生，该参考镜在固定频率下恒定激发以获得控制信号。图片来源：科学报告，doi：10.1038 / s41598-019-49422-4。

研究团队在目前的工作中显着改进了生物反应器的设计，与之前提出的原型相比，形成了更轻的基础。他们使用AD9833电源波形发生器进行电源调节，并且可以轻松调节并保持适当的滤波，以获得纯1 kHz正弦波驱动信号。研究人员获得了滤波前和滤波后信号的功率谱，以估算发生器的功率谱密度。他们使用激光干涉仪验证了生物反应器的FEA建模和校准，以确定位移的纳米级变化。科学家们使用粘合在每个井底面的棱柱形反射带来测量与生物反应器磁性连接的培养皿孔尺寸。

该技术具有巨大的空间，可以从接种在胶原凝胶中的MSCs中生成三维矿化基质，形成骨骼支架。例如，培养的细胞在振动期间接受周期性加速力，其作用于细胞膜和细胞骨架以诱导骨生成。该效应还可能与细胞培养基中的环境刚度有关，影响干细胞分化并诱导MSC中的骨生成。为了区分原因，Campsie等人。当他们对胶原凝胶进行纳米振动时，使用AFM来检测刚度的任何变化。他们没有观察到凝胶内应变硬化的显着影响和杨氏模量保持软胶原凝胶的值 ; 因此，将细胞分化归因于单独的纳米振动。

TOP：纳米振动过程中胶原凝胶的AFM测量。(A)将振动压电致动器连接到含有胶原凝胶的培养皿上，AFM悬臂用于测量振动期间凝胶硬度的任何变化。(B)通过AFM评估在三种不同压电振幅下纳米振动的胶原样品的杨氏模量。数据是平均值±SD(n> 30)。底部：纳米振动刺激三周时的蛋白质表达。以1kHz和30nm置换的频率与未刺激的对照一起刺激细胞三周。相对于静态对照测量RUNX2，OSX，OPN，OCN和ALP的蛋白质表达，并使用LI-COR Odyssey系统(LI-COR，Nebraska，USA)定量。与未刺激的对照相比，在机械刺激的样品中观察到统计学上显着更高的表达(由红色虚线表示)。数据是平均值±标准差，n = 4，stats Mann Whitney U-检验* p <0.05。图片来源：科学报告，doi：10.1038 / s41598-019-49422-4。

在纳米振动期间，细胞经历分化以形成通过相对于骨发育适度上调基因而观察到的成骨谱系。由于骨相关蛋白表达更多地是这种转换的明确指标，科学家们测试了纳米振动3周，刺激与未刺激的MSCs对已知的成骨相关蛋白表达。他们观察了Runt相关转录因子2(RUNX2)，osterix(OSX)，骨桥蛋白(OPN)，骨钙素(OCN)和碱性磷酸酶的表达(ALP)蛋白质，与未刺激的对照相比。成骨分化的蛋白质生物标志物的表达表明新设计的生物反应器成功刺激MSC成骨的能力。

通过这种方式，Paul Campsie及其同事开发了一种生物反应器系统，该系统在研究项目或小型临床试验的规模上发挥了充分的作用。该设备提供机械刺激，振幅接近30nm，频率为1kHz。为了应对机械转导对控制骨骼研究中细胞行为和干细胞分化的兴趣日益增长，研究团队对系统进行了优化，以提供更广泛的频率范围。这项新工作将开启一个全新的机械生物学领域，通过'nanokicking刺激其他细胞类型具有无法预料的潜力“未来的工作将集中在改进的系统上，以便为更大量的细胞提供机械刺激。